近日，水产与生命学院李名友和桂朗团队开创性的应用鱼类生殖干细胞培养技术，首次建立了马口鱼的精原干细胞系和长江刀鲚的性腺体细胞系，通过体外长期培养后成功产生精子，突破了目前世界范围内无法长期培养经济鱼类生殖干细胞的问题，为鱼类濒危物种保护、重要经济鱼类种质创制、生殖干细胞基因编辑等提供了一条新途径。

论文成果

 技术流程

动物生殖细胞是唯一携带遗传信息，维持物种延续。原始生殖细胞在生殖腺形成之前，已在胚胎的囊胚期特定位置形成，随后迁移到原始生殖腺，分化为卵原干细胞和精原干细胞。精原干细胞通过减数分裂产生精子。体外重建精子发生微环境，精原干细胞经性腺体细胞诱导亦可产生精子。新加坡国立大学洪云汉教授，2004年开创了鱼类无滋养层干细胞培养技术，建立模式动物青鳉长期稳定培养的精原干细胞并产生精子。随后，世界众多实验室开展此项技术研究，期望应用于其他濒危鱼类或重要经济鱼类，然而仅能获得培养时间不超过1个月的短期培养精原干细胞。

生殖细胞的形成过程

 马口鱼精原干细胞系的诱导分化为体细胞和精子

在本研究中，马口鱼精原干细胞系经过2年多的培养，仍具有二倍体核型，生长稳定，具有典型的精原干细胞基因表达模式。在体外培养条件下，马口鱼精原干细胞系可以诱导分化为精子和其他不同类型的体细胞。在体外培养条件下，马口鱼精原干细胞系在悬浮培养中形成拟胚体。在用视黄酸连续处理一周后，分化成神经元、星形胶质细胞和上皮细胞等多种体细胞，这表明马口鱼精原干细胞系在体外具有多能性。为了模拟体外减数分裂过程，团队将马口鱼精原干细胞系与马口鱼精巢细胞共培养。分别收集精巢细胞和表达红色荧光（RFP）的马口鱼精原干细胞，通过流式细胞进行染色体检查，发现细胞可以进入并完成减数分裂以产生单倍体产物。在共培养的第14天，观察到表达RFP的精子细胞，表明马口鱼精原干细胞逐渐诱导为未成熟精子细胞。共培养16天后，观察到表达RFP的马口鱼精原干细胞分化为更成熟的精子，尾部有轻微摆动行为。本研究验证了在合适的诱导条件下，马口鱼精原干细胞可以诱导产生精子细胞。

研究表明，马口鱼精原干细胞在体内也具有多能性，将表达RFP的马口鱼精原干细胞移植到斑马鱼胚胎中发现，供体与斑马鱼胚胎发育形成了嵌合体并表现出正常的增殖和分化能力，能发育成来源于三个不同胚层的细胞。

马口鱼精原干细胞在斑马鱼胚胎分化形成不同胚层的细胞

与此同时，研究表明体细胞在精子发生过程中扮演重要角色，可通过运用体细胞与精原干细胞共培养条件模拟体内微环境，诱精原干细胞体外分化，经历减数分裂产生精子细胞。在长江刀鲚体细胞系研究中，将刀鲚性腺体细胞与表达RFP的青鳉精原干细胞系共同培养两天后，可以观察到紧密排列的多细胞集落，具有明显的胚状体边界。青鳉精原干细胞的形态发生了变化，观察到圆形精子细胞转化为伸长的精子细胞，并带有新形成的鞭毛。因此，刀鲚性腺体细胞具有诱导青鳉精原干细胞分化为精子的能力。

刀鲚体细胞体外诱导青鳉精原干细胞精子发生

此次研究突破了无法长期培养养殖鱼类精原干细胞系的问题，通过体内外的多角度诱导和移植研究，使精原干细胞体外形成了精子。这为对精原干细胞的进一步研究和认识提供了基础，也为保护鱼类濒危物种、优化具有重要经济价值鱼类育种的方式提供了新的思路。今后，李名友、桂朗团队将结合干细胞培养和诱导技术、基因编辑技术和细胞移植技术等多种研究手段，建立繁殖困难、繁殖周期长、珍稀或濒危鱼类生殖干细胞体系，开展生殖干细胞基因编辑介导的养殖鱼类优良种质创制新技术。

此次两项研究成果以“Generation of a Normal Long-Term-Cultured Chinese Hook Snout Carp Spermatogonial Stem Cell Line Capable of Sperm Production In Vitro”（链接： https://www.mdpi.com/2079-7737/11/7/1069 ）和“Establishment of a Coilia nasus gonadal somatic cell line capable of sperm induction In Vitro”（链接：https://www.mdpi.com/2079-7737/11/7/1049 ）为题发表于Biology上。此次研究由陈霄（硕士生）、阚宇婷（硕士生）和仲颖（博士后）等人完成，通讯作者为李名友教授和桂朗副教授。此次两项研究得到国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项项目（批准号: 2018YFD0901205）和自然基金面上项目（批准号: 31672700）的资助。

（供稿：水产与生命学院）